Elektrofiziološke meritve nanometrskih razsežnosti

Opis predmeta

Snov je razdeljena na več delov (npr. nekaj iztočnic iz zgodovine elektrofiziologije, analogno vezje membrane, ponazoritev mirovnega membranskega potenciala, ponazoritev meritve potenciala motorične ploščice in akcijskega potenciala, meritve tokov prek membrane, metoda vpete napetosti [voltage-clamp]), meritve membranske kapacitivnosti, kombinacija optičnih metod za študij homeostaze citosolnega kalcija skupaj z elektrofiziološkimi metodami, uporaba metod molekularne biologije in elektrofiziologije skupaj z metodami za slikanje subcelularnih struktur. Študent uporabi pridobljeno znanje pri svojem delu tako, da reši naloge, ki so povezane z lastnim raziskovalnim problemom in izlušči iz literature znanstveni problem, ki ga skuša rešiti z metodami, ki jih obravnava ta predmet.

Pri predmetu sodelujejo zn. sod. dr. Jernej Jorgačevski, zn. sod. dr. Matjaž Stenovec in drugi vabljeni predavatelji.

Cilji in kompetence

Elektrofiziologija je veja fiziologije, ki se je uveljavila tako v rutinskem, kliničnem raziskovalnem (elektroencefalografija, elektrokardiografija, elektromiogragija) kot v temeljnem raziskovalnem delu. V slednjem se sicer še vedno ponekod uporablja v obliki ekstracelularne, bipolarne ali unipolarne registracije, večinoma pa vse bolj kot mikroelektrofiziologija in nanoelektrofiziologija, s katero lahko študiramo lastnosti posamezne molekule ali osamljenih delov membrane ali celičnih predelkov. Tu uporabljamo različne steklene mikroelektrode, npr. za registracijo intracelularnih sinaptičnih potencialov, sinaptičnega toka (metoda voltage-clamp), aktivacija in lastnosti posameznih membranskih kanalčkov (metoda patch-clamp) ter meritve ekso- in endocitoze hormonsko aktivnih in drugih celic z merjenjem lastnosti fuzijske pore, ki imajo premer manjši od nanometra (metoda patch-clamp v različici whole-cell recording, cell-attached recording, inside-out in outside out recording). Cilj predmeta je pridobitev temeljnih znanj za pristop k raziskavam membranskih procesov evkariontskih celic in njenih podceličnih predelkov. Slušatelj bo pridobil  temeljne kompetence za uporabo elekrofizioloških metod pri raziskovalnem delu na posamezni celici; ki s svojim delovanjem prispevajo k delovanju tkih in višjih organizacijskih enot.

Metode poučevanja in učenja

Kandidati bodo študirali teme, o katerih bodo opravljene predstavitve učitelj-učenec, oziroma bodo obravnavane v obliki konzultacij; pripraviti bodo morali več seminarskih nalog in praktično delo v laboratoriju.

Predvideni študijski rezultati

Znanje in razumevanje:

Študent se nauči osnov sledečih metod: Metoda vpete napetosti, metode vpete napetosti krpice membrane (angl. The patch-clamp technique) za meritve tokov in napetostnih sprememb prek membarne cele celice, za meritve tokov skozi posamezni kanal, makroskopske in mirksoskopske meritve membranske kapacitete, ki zrcalijo celične proceses ekso- in endocitoze. Kombinirane elektrofiziološke in optofiziološke metode (metode za fotolizo vklenjenih sekundarnih prenašalcev) z metodami za fluorescenčno označevanje subceličnih predelkov.

Reference nosilca

akad. prof. dr. Robert Zorec

KABASO, Doron, JORGAČEVSKI, Jernej, COSTA CALEJO, Ana-Isabel, FLAŠKER, Ajda, GUČEK, Alenka, KREFT, Marko, ZOREC, Robert. Comparison of unitary exocytic events in pituitary lactotrophs and in astrocytes : modeling the discrete open fusion-pore states. Frontiers in cellular neuroscience, ISSN 1662-5102, Apr. 2013, vol. 7.

COSTA CALEJO, Ana-Isabel, JORGAČEVSKI, Jernej, SILVA, V.S., STENOVEC, Matjaž, KREFT, Marko, GONÇALVES, Paula P., ZOREC, Robert. Aluminium-induced changes of fusion pore properties attenuate prolactin secretion in rat pituitary lactotrophs. Neuroscience, ISSN 0306-4522. [Print ed.], 2012, vol. 201, str. 57-66, ilustr., doi:10.1016/j.neuroscience.2011.11.015.

KABASO, Doron, GONGADZE, Ekaterina, JORGAČEVSKI, Jernej, KREFT, Marko, VAN RIENEN, Ursula, ZOREC, Robert, IGLIČ, Aleš. Exploring the binding dynamics of bar proteins. Cellular & molecular biology letters, ISSN 1425-8153, 2011, vol. 16, no. 3, str. 398-411 in S1-S8, ilustr.

THIEL, Gerhard, KREFT, Marko, ZOREC, Robert. Rhythmic kinetics of single fusion and fission in a plant cell protoplast. Annals of the New York Academy of Sciences, ISSN 0077-8923, 2009, letn. 1152, str. 1-6, doi: 10.1111/j.1749-6632.2008.03996.x.

DARIOS, Frédéric, WASSER, Catherine, SHAKIRZYANOVA, Anastasia, GINIATULLIN, Artur, JORGAČEVSKI, Jernej, KREFT, Marko, ZOREC, Robert, et al. Sphingosine facilitates SNARE complex assembly and activates synaptic vesicle exocytosis. Neuron, ISSN 0896-6273, 2009, letn. 62, str. 683-694, doi: 10.1016/j.neuron.2009.04.024.

VARDJAN, Nina, STENOVEC, Matjaž, JORGAČEVSKI, Jernej, KREFT, Marko, GRILC, Sonja, ZOREC, Robert. The fusion pore and vesicle cargo discharge modulation. Annals of the New York Academy of Sciences, ISSN 0077-8923, 2009, letn. 1152, str. 135-144, doi: 10.1111/j.1749-6632.2008.04007.x.

prof. dr. Marko Kreft

COSTA CALEJO, Ana-Isabel, JORGAČEVSKI, Jernej, KUCKA, Marek, KREFT, Marko, GONÇALVES, Paula P., STOJILKOVIĆ, Stanko, ZOREC, Robert. cAMP-mediated stabilization of fusion pores in cultured rat pituitary lactotrophs. The Journal of neuroscience, ISSN 0270-6474, May 2013, vol. 33, iss. 18, str. 8068-8078, ilustr., doi:10.1523/JNEUROSCI.5351-12.2013.

RITUPER, Boštjan, GUČEK, Alenka, JORGAČEVSKI, Jernej, FLAŠKER, Ajda, KREFT, Marko, ZOREC, Robert. High-resolution membrane capacitance measurements for the study of exocytosis and endocytosis. Nature protocols, ISSN 1754-2189, 2013, vol. 8, no. 6, str. 1169-1183, ilustr., doi: 10.1038/nprot.2013.069.

JORGAČEVSKI, Jernej, KREFT, Marko, VARDJAN, Nina, ZOREC, Robert. Fusion pore regulation in peptidergic vesicles. Cell calcium, ISSN 0143-4160, 2012, vol. 52, iss. 3/4, str. 270-276, doi: 10.1016/j.ceca.2012.04.008.

TRKOV, Saša, STENOVEC, Matjaž, KREFT, Marko, POTOKAR, Maja, PARPURA, Vladimir, DAVLETOV, Bazbek, ZOREC, Robert. Fingolimod-A sphingosine-like molecule inhibits vesicle mobility and secretionin astrocytes. Glia, ISSN 0894-1491, 2012, vol. 60, no. 9, str. 1406-1416, doi: 10.1002/glia.22361.

KABASO, Doron, COSTA CALEJO, Ana-Isabel, JORGAČEVSKI, Jernej, KREFT, Marko, ZOREC, Robert, IGLIČ, Aleš. Fusion pore diameter regulation by cations modulating local membrane anisotropy. TheScientificWorldjournal, ISSN 1537-744X, 2012, vol. 2012, str. [1-7], ID 983138. http://www.tswj.com/2012/983138, doi: 10.1100/2012/983138

VARDJAN, Nina, STENOVEC, Matjaž, JORGAČEVSKI, Jernej, KREFT, Marko, ZOREC, Robert. Fusion pore: an evolutionary invention of nucleated cells. European review, ISSN 1062-7987, 2010, vol. 18, no. 3, str. 347-364, ilustr., doi: 10.1017/S1062798710000074.

Doc. dr. Helena Chowdhury

RITUPER, Boštjan, CHOWDHURY HAQUE, Helena, JORGAČEVSKI, Jernej, COORSSEN, Jens R., KREFT, Marko, ZOREC, Robert. Cholesterol-mediated membrane surface area dynamics in neuroendocrine cells. Biochimica et biophysica acta. Molecular and cell biology of lipids, ISSN 1388-1981, Jul. 2013, vol. 1831, iss. 7, str. 1228-1238

POTOKAR, Maja, LACOVICH, Valentina, CHOWDHURY HAQUE, Helena, KREFT, Marko, ZOREC, Robert. Rab4 and Rab5 GTPase are required for directional mobility of endocytic vesicles in astrocytes. Glia, ISSN 0894-1491, 2012, vol. 60, issue 4, str. 594-604, ilustr., doi: 10.1002/glia.22293.

PREBIL, Mateja, CHOWDHURY HAQUE, Helena, ZOREC, Robert, KREFT, Marko. Changes in cytosolic glucose level in ATP stimulated live astrocytes. Biochemical and biophysical research communications, ISSN 0006-291X, 2011, vol. 405, issue. 2, str. 308-313, doi: 10.1016/j.bbrc.2011.01.035.

KOVAČIČ, Petra Brina, CHOWDHURY HAQUE, Helena, VELEBIT MARKOVIĆ, Jelena, KREFT, Marko, JENSEN, Jørgen, ZOREC, Robert. New insights into cytosolic glucose levels during differentiation of 3T3-L1 fibroblasts into adipocytes. The Journal of biological chemistry, ISSN 0021-9258, 2011, vol. 286, no. 15, str. 13370-13381, ilustr., doi:10.1074/jbc.M110.200980.

VELEBIT MARKOVIĆ, Jelena, CHOWDHURY HAQUE, Helena, KREFT, Marko, ZOREC, Robert. Rosiglitazone balances insulin-induced exo- and endocytosis in single 3T3-L1 adipocytes. Molecular and cellular endocrinology, ISSN 0303-7207. [Print ed.], 2011, vol. 333, issue 1, str. 70-77, doi: 10.1016/j.mce.2010.12.014.

KREFT, Marko, PREBIL, Mateja, CHOWDHURY HAQUE, Helena, GRILC, Sonja, JENSEN, Jørgen, ZOREC, Robert. Analysis of confocal images using variable-width line profiles. Protoplasma, ISSN 0033-183X, 2010, letn. 246, št. 1/4, str. 73-80, doi: 10.1007/s00709-010-0127-7.

Temeljni viri in literatura

Katz B: Nerve. muscle, synapse. McGraw-Hill, 1966

Aidley DJ: The physiology of excitable cells. Cambridge Univ. Press, 1991.

Hille B (1992). Ionic channels of excitable membranes. Sinauer Associates.;

Sperelakis N (2012) Cell Physiology. Academic Press.

Zorec, R (1988). Ionski kanalčki v celični membrani. Kaj lahko raziskujemo z metodo "patch clamp"?. Med. razgl., 27, št.1 (1988), str.37-53.

Sakmann B in Neher E (1995) Single Channel Recording 2nd ed. Plenum Press, New York