DomovPredmetiPreučevanje bioloških procesov na ravni genoma, transkriptoma in proteoma

Preučevanje bioloških procesov na ravni genoma, transkriptoma in proteoma

Opis predmeta

Izziv današnjega raziskovalnega dela predstavlja povezovanje znanj in eksperimentalnih podatkov posameznih raziskovalnih področij (npr. genomika, transkriptomika, proteomika) in generacija vedno večjih setov podatkov. S tem individualnim raziskovalnim predmetom želimo podati študentu preko laboratorijskih primerov vpogled v konkretne raziskovalne primere in primere obdelav rezultatov s področij genomike, transkriptomike in proteomike:

1) Kvantificiranje DNA/RNA

Kvantificiranje DNA/RNA je obsežno področje, ki se široko uporablja v biotehnoloških raziskavah. Za določevanje tarčnega produkta se tako uporabljajo nekatere tradicionalne metode, kot npr. spektrofotometrija ali PicoGreen dsDNA kvantificiranje, ki niso vrstno specifične, medtem ko je zelo natančno določanje tarčnih genov / DNA / RNA omogočeno predvsem z metodami, ki temeljijo na tehnologiji verižne reakcije. Uporabljajo se v širokem obsegu za DNA kvantificiranje saj amplifikacija tarčne sekvence omogoča visoko občutljivost detekcije. Pri kvantitativnih PCR (QPCR) tehnikah je količina tarčnega gena povezana z intenziteto fluorescence reporterskih molekul. Signal fluorescence na osnovi katerega želimo izračunati začetno količino tarčnega gena lahko merimo na koncu reakcije (endpoint QPCR) ali pa med samim potekom reakcije (real-time QPCR). Novejša tehnologija imenovana digitalni PCR (dPCR) pa je verzija klasičnega PCR-ja, ki se lahko direktno uporablja za kvantificiranje in pomnoževanje nukleinskih kislin. Največja razlika med njima je v tem, da je pri dPCR vzorec razdeljen na veliko število manjših delov v katerih potekajo posamezne reakcije.

V sklopu tega predmeta se bodo študentje seznanili predvsem z uporabo in aplikacijami tehnologije PCR v realnem času, ki je zaenkrat najboj široko uporabna.

2) Obdelava genomskih in transkriptomskih NGS podatkov – uporabna bioinformatika

V zadnjih nekaj letih so postopki naslednjih generacij določevanja nukleotidnih zaporedij (NGS) povsem spremenili področje genomike in transkriptomike. V tem sklopu predmeta se bodo študenti seznanili z naslednjimi aktivnostmi:

a) Hiter vpogled s trenutnimi NGS tehnologijami, ki so aktualne

b) NCBI-jev arhiv »Sequence Read Archive«, čemu je namenjen, prenos surovih podatkov sekvenciranja različnih platform, seznanitev s formati teh podatkov, pretvorba podatkov s pomočjo programskega paketa »SRA Toolkit«

c) Analiza kvalitete NGS podatkov (QC analysis) in interpretacija analize

d) Čiščenje surovih NGS podatkov

e) Osnovni formati NGS podatkov, seznanitev z njimi, njihova obdelava (FASTQ, SAM, BAM, GFF, VCF, BED)

f) De-novo zlaganje in rekonstrukcija zaporedij na osnovi mapiranja

g) Vizualizacija NGS podatkov.

3) Preučevanje proteoma

Različni omski pristopi omogočajo preučevanje bioloških procesov na molekularni ravni. Med njimi ima proteomika pomembno prednost, kajti preučuje proteine, ki so nosilci funkcij vsake žive celice. Z uporabo različnih proteomskih orodij lahko pridobimo informacijo o izražanju proteinov, njihovih posttranslacijskih modifikacijah in proteinskih interakcijah.

Študenti se bodo v tem sklopu praktično seznanili z naslednjimi aktivnostmi:

– Priprava biološkega materiala – vzorčenje in priprava vzorca za proteomsko analizo

– Analiza proteoma z 2-D elektroforezo

– Obdelava 2-D slik gelov z računalniškim programom

– Vrednotenje rezultatov identifikacije proteinov, pridobljenih z masno spektroskopijo.

Cilji in kompetence

Namen predmeta je:

1) predstaviti tehnike kvantificiranja DNA/RNA ter jih podpreti s konkretnimi laboratorijskimi poskusi in izračuni ter vrednotenji dobljenih rezultatov,

2) seznaniti študente z osnovnimi karakteristikami podatkov NGS, njihovimi oblikami, podatkovnimi bazami za shranjevanje, ter s potekom analize.

3) predstaviti analizo proteoma od priprave vzorca, separacije proteinov do vrednotenja proteomskih podatkov

Študenti bodo preko praktičnih primerov spoznali, kako razumeti biološke procese na ravni genoma, transkriptoma in proteoma in znali pravilno načrtovati eksperiment.

Metode poučevanja in učenja

Teoretične osnove
Praktično laboratorijsko delo oz. delo z računalnikom
Analiza rezultatov s pomočjo programske opreme in različnih računalniških aplikacij

Predvideni študijski rezultati

Znanje in razumevanje:

Pridobitev znanja s področja postavitve poskusa za PCR v realnem času
Razumevanje in poznavanje metod in tehnik za določanje količine tarčnega gena v vzorcu oz. izražanje posameznih tarč z metodo PCR v realnem času.
Analiza podatkov in vrednotenje rezultatov z različnimi metodološkimi pristopi.
Statistična analiza rezultatov in grafična predstavitev
Poznavanje osnov uporabne bioinformatike na primerih NGS podatkov
Poznavanje pomena proteomike za razumevanje bioloških procesov in sposobnost načrtovanja proteomskega eksperimenta od priprave biološkega materiala do analize proteoma z 2-D elektroforezo in obdelavo podatkov.

Reference nosilca

Nataša Štajner

1. ŠTAJNER, Nataša, JAVORNIK CREGEEN, Sara Joan, JAVORNIK, Branka. Evaluation of reference genes for RT-qPCR expression studies in hop (Humulus lupulus L.) during infection with vascular pathogen Verticillium albo-atrum. PloS one, ISSN 1932-6203, 2013, vol. 8, issue 7, str. 1-13 (e68228), ilustr.http://dx.doi.org/10.1371/journal.pone.0068228, doi: 10.1371/journal.pone.0068228. [COBISS.SI-ID 7653753]

2. REŠETIČ, Tjaša, ŠTAJNER, Nataša, BANDELJ MAVSAR, Dunja, JAVORNIK, Branka, JAKŠE, Jernej. 2. Validation of candidate reference genes in RT-qPCR studies of developing olive fruit and expression analysis of four genes involved in fatty acids metabolism. Molecular breeding, ISSN 1380-3743. [Tiskana izd.], 2013, vol. 32, issue 1, str. 211-222.http://dx.doi.org/10.1007/s11032-013-9863-7, doi: 10.1007/s11032-013-9863-7. [COBISS.SI-ID 7527801]

3. ORAŽEM, Petra, ŠTAJNER, Nataša, BOHANEC, Borut. Effect of X-ray irradiation on olive shoot culture evaluated by morphological measurements, nuclear DNA content and SSR and AFLP markers. Trees, ISSN 0931-1890, 2013, vol. 27, issue 6, str. 1587-1595, ilustr. http://link.springer.com/content/pdf/10.1007%2Fs00468-013-0906-9.pdf, doi:10.1007/s00468-013-0906-9. [COBISS.SI-ID 7652217]

4. JAKŠE, Jernej, ŠTAJNER, Nataša, LUTHAR, Zlata, JELTSCH, Jean-Marc, JAVORNIK, Branka. Development of transcript-associated microsatellite markers for diversity and linkage mapping studies in hop (Humulus lupulus L.). Molecular breeding, ISSN 1380-3743. [Tiskana izd.], 2011, vol. 28, no. 2, str. 227-239. http://dx.doi.org/10.1007/s11032-010-9476-3, doi: 10.1007/s11032-010-9476-3. [COBISS.SI-ID 6353273]

5. RUSJAN, Denis, JUG, Tjaša, ŠTAJNER, Nataša. Evaluation of genetic diversity: which of the varieties can be named 'Rebula' (Vitis vinifera L.)?. Vitis, ISSN 0042-7500, 2010, vol. 49, no. 4, str. 189-192. [COBISS.SI-ID 6464889]

6. ŠTAJNER, Nataša, ŠATOVIĆ, Zlatko, ČERENAK, Andreja, JAVORNIK, Branka. Genetic structure and differentiation in hop (Humulus lupulus L.) as inferred from microsatellites. Euphytica, ISSN 0014-2336. [Print ed.], 2008, vol. 161, no. 1-2, str. 301-311. http://dx.doi.org/10.1007/s10681-007-9429-z, doi: 10.1007/s10681-007-9429-z. [COBISS.SI-ID 5469817]

7. JAKŠE, Jernej, ŠTAJNER, Nataša, KOZJAK, Petra, ČERENAK, Andreja, JAVORNIK, Branka. Trinucleotide microsatellite repeat is tightly linked to male sex in hop (Humulus lupulus L.). Molecular breeding, ISSN 1380-3743. [Tiskana izd.], 2008, vol. 21, no. 2, str. 139-148. [COBISS.SI-ID 5111417]

8. ŠTAJNER, Nataša, KOROŠEC-KORUZA, Zora, RUSJAN, Denis, JAVORNIK, Branka. Microsatellite genotyping of old Slovenian grapevine varieties (Vitis viniferaL.) of the Primorje (coastal) winegrowing region. Vitis, ISSN 0042-7500, 2008, vol. 47, no. 4, str. 201-204. [COBISS.SI-ID 5704825]

Polona Jamnik

1. PETELINC, Tanja, POLAK, Tomaž, JAMNIK, Polona. Insight into the molecular mechanisms of propolis activity using a subcellular proteomic approach. Journal of agricultural and food chemistry, ISSN 0021-8561, 2013, vol. 61, str. 11502-11510, doi: 10.1021/jf4042003. [COBISS.SI-ID 4320376]

2. IVANČIČ, Tina, JAMNIK, Polona, STOPAR, David. Cold shock CspA and CspB protein production during periodic temperature cycling in Escherichia coli. BMC research notes, ISSN 1756-0500, 2013, vol. 6, article no. 248, str. 1-9. http://www.biomedcentral.com/content/pdf/1756-0500-6-248.pdf, doi: 10.1186/1756-0500-6-248. [COBISS.SI-ID 4262776]

3. JEVNIKAR, Zala, ROJNIK, Matija, JAMNIK, Polona, DOLJAK, Bojan, PEČAR FONOVIĆ, Urša, KOS, Janko. Cathepsin H mediates the processing of talin and regulates migration of prostate cancer cells. The Journal of biological chemistry, ISSN 0021-9258, 2013, vol. 288, str. 2201-2209. http://www.jbc.org/content/288/4/2201.abstract, doi: 10.1074/jbc.M112.436394. [COBISS.SI-ID 3390321]

4. PEČAR FONOVIĆ, Urša, JEVNIKAR, Zala, ROJNIK, Matija, DOLJAK, Bojan, FONOVIĆ, Marko, JAMNIK, Polona, KOS, Janko. Profilin 1 as a target for cathepsin X activity in tumor cells. PloS one, ISSN 1932-6203, 2013, vol. 8, iss. 1, str. 1-9, e53918. http://www.plosone.org/article/info%3Adoi%2F10.1371%2Fjournal.pone.0053918, doi: 10.1371/journal.pone.0053918. [COBISS.SI-ID 3375217]

5. PETELINC, Tanja, POLAK, Tomaž, DEMŠAR, Lea, JAMNIK, Polona. Fractionation of phenolic compounds extracted from propolis and their activity in the yeast Saccharomyces cerevisiae. PloS one, ISSN 1932-6203, 2013, vol. 8, no. 2, str. 1-8, e56104, doi: 10.1371/journal.pone.0056104. [COBISS.SI-ID 4205944]

6. MANDELC, Stanislav, RADIŠEK, Sebastjan, JAMNIK, Polona, JAVORNIK, Branka. Comparison of mycelial proteomes of two Verticillium albo-atrum pathotypes from hop. European journal of plant pathology, ISSN 0929-1873, 2009, vol. 125, no. 1, str. 159-171. http://dx.doi.org/10.1007/s10658-009-9467-6, doi: 10.1007/s10658-009-9467-6. [COBISS.SI-ID 5973881]

Jernej Jakše

1. REŠETIČ, Tjaša, ŠTAJNER, Nataša, BANDELJ MAVSAR, Dunja, JAVORNIK, Branka, JAKŠE, Jernej. Validation of candidate reference genes in RT-qPCR studies of developing olive fruit and expression analysis of four genes involved in fatty acids metabolism. Molecular breeding, ISSN 1380-3743. [Tiskana izd.], 2013, vol. 32, issue 1, str. 211-222. http://dx.doi.org/10.1007/s11032-013-9863-7, doi: 10.1007/s11032-013-9863-7. [COBISS.SI-ID 7527801]

2. ŠKOF, Suzana, ČERENAK, Andreja, JAKŠE, Jernej, BOHANEC, Borut, JAVORNIK, Branka. Ploidy and sex expression in monoecious hop (Humulus lupulus). Botany, ISSN 1916-2790. [Tiskana izd.], 2012, vol. 90, no. 7, str. 617-626. http://dx.doi.org/10.1139/b2012-037. [COBISS.SI-ID 7165817]

3. MCMANUS, Michael T., JOSHI, Srishti, SEARLE, Bruce, PITHER-JOYCE, Meeghan, SHAW, Martin, LEUNG, Susanna, ALBERT, Nick, SHIGYO, Masayoshi, JAKŠE, Jernej, HAVEY, Michael J., MCCALLUM, A. John. Genotypic variation in sulfur assimilation and metabolism of onion (Allium cepa L.). III, Characterization of sulfite reductase. Phytochemistry, ISSN 0031-9422. [Print ed.], 2012, vol. 83, str. 34-42, doi: 10.1016/j.phytochem.2012.07.028. [COBISS.SI-ID 7272313]

4. JAKŠE, Jernej, MEYER, Jenelle D. F., SUZUKI, Go, MCCALLUM, A. John, CHEUNG, Foo, TOWN, Christopher, HAVEY, Michael J. Pilot sequencing of onion genomic DNA reveals fragments of transposable elements, low gene densities, and significant gene enrichment after methyl filtration. Molecular genetics and genomics, ISSN 1617-4615, 2008, vol. 280, no. 4, str. 287-292. http://dx.doi.org/10.1007/s00438-008-0364-z, doi: 10.1007/s00438-008-0364-z. [COBISS.SI-ID 5621625]

5. KOZJAK, Petra, JAKŠE, Jernej, JAVORNIK, Branka. Isolation and sequence analysis of NBS-LRR disease resistance gene analogues from hop Humulus lupulus L. Plant science, ISSN 0168-9452. [Print ed.], 2009, vol. 176, issue 6, str. 775-782, doi: 10.1016/j.plantsci.2009.02.021. [COBISS.SI-ID 5895289]

6. HIRSCHEGGER, Pablo, JAKŠE, Jernej, TRONTELJ, Peter, BOHANEC, Borut. Origins of Allium ampeloprasum horticultural groups and a molecular phylogeny of the section Allium (Allium: Alliacea). Molecular phylogenetics and evolution, ISSN 1055-7903, 2010, vol. 54, no. 2, str. 488-497. http://dx.doi.org/10.1016/j.ympev.2009.08.030, doi: 10.1016/j.ympev.2009.08.030. [COBISS.SI-ID 6122873]

Temeljni viri in literatura

1) Real-time PCR handbook. 2012, Real-Time PCR 2nd Edition, Life Technologies Corporation (6 Chapters and 66 pages)

2) Bioinformatics for High Throughput Sequencing. Rodríguez-Ezpeleta, Naiara, Hackenberg, Michael, Aransay, Ana M. (Eds.) 2012, XI, 255p. 29 illus., 25 illus. in color.

3) Revialni in originalni znanstveni članki s področja/Review and original scientific articles from the field.