Sodobne biotehnološke metode

Opis predmeta

Proteini: Čiščenje: viri proteinov; homogenizacija; centrifugiranje; ultrafiltracija; dializa; principi različnih vrst tekočinske kromatografije (gelska, hidrofobna, ionska, afinitetna …) in načini njihove izvedbe (klasična, FPLC, HPLC …); elektroforetske metode (nativna in NaDS PAGE, izoelektrično fokusiranje, prenos Western); izolacija membranskih proteinov (detergenti …). Metode za detekcijo, kvantifikacijo in karakterizacijo proteinov: v raztopinah, gelih, bioloških membranah in na sintetičnih membranah (imunološke, radioizotopske in spektroskopske metode, barvila). Strukturna karakterizacija proteinov: določanje aminokislinske sestave in zaporedja, post-translacijskih modifikacij. Proteomika: 2D PAGE; masna spektrometrija, tehnologija MudPIT.

Nukleinske kisline (NK): Izolacija in čiščenje (biološki viri/tkiva – shranjevanje in homogeniziranje; varnostni ukrepi; obarjanje in centrifugiranje NK; elektroforezne metode in izolacija NK; kromatografske metode; subtrakcija). Izdelava genske knjižnice/banke (restrikcijski encimi, fragmentiranje DNA, delna restrikcija, metoda PCR in njene izvedenke; vektorji za prenos DNA, vnos in kloniranje DNA v različnih gostiteljskih celicah, selekcija rekombinantnih klonov; genomske in cDNA knjižnice). Preiskava genskih knjižnic (gensko-specifične sonde, hibridizacija kolonij/plakov, ekspresijske knjižnice; RFLP, pozicijsko kloniranje, sprehod/skok po kromosomu). Določanje nukleotidnega zaporedja (metoda po Sangerju, po-genomski pristopi – avtomatizacija). Karakterizacija NK (restrikcijska analiza, prenosa Southern in Northern; iskanje podobnosti nukleotidnih zaporedij; analiza genskih mutacij in polimorfizmov). Mutageneza (naključna in usmerjena/mestno-specifična mutageneza; proteinsko inženirstvo). Izražanje tujih genov (fuzijski proteini, sekrecija; analiza mRNA, RT-PCR; hibridizacija in situ, FISH; »DNA-prstni odtis«; kvasni dvohibridni sistem; diferenčne metode, fagni prikaz, qPCR, DNA mikromreže (bio-čipi)). Transgeneza pri evkariontih (opis metod; utišanje genov). Preurejanje genomov (CRISPR/Cas, gensko zdravljenje, imunonoterapija/CAP-T). Analiza genomov (kartiranje, določanje nukleotidnih zaporedij, primerjalna genomika; transkriptomika). Bioinformatika, podatkovne baze in Internet.

Cilji in kompetence

Temeljni izobraževalni cilj je seznanitev študentov z metodami in tehnikami sodobne biokemije in molekularne biologije s posebnim poudarkom na tistih, ki se uporabljajo v tako imenovani 'sodobni biotehnologiji'. Predmet usmerja študenta k samostojnemu teoretičnemu (analiza literature, reševanje problemo, sinteza zaključkov, sposobnost reševanja problemov) in eksperimentalnemu delu (organiziranje in načrtovanje dela).

Metode poučevanja in učenja

Predavanja, vodene diskusija, problemsko-zasnovano učenje, demonstracije v laboratoriju, konzultacije.

Predvideni študijski rezultati

Študent spozna ali poglobi znanje o metodah in tehnikah analize proteinov in nukleinskih kislin. Predmet usmerja študenta k uporabi  pridobljenega znanja v temeljnih ali aplikativnih raziskavah na področju njegovega raziskovalnega ali razvojnega dela. Usmerja ga k samostojnemu načrtovanju analitskih postopkov, reševanju problemov z organiziranjem in načrtovanjem eksperimentalnega dela.

Reference nosilca

Igor Križaj:

Latinović, Z., Leonardi, A., Koh, C.Y., Kini, R.M., Trampuš Bakija, A., Pungerčar, J. and Križaj, I. (2020): The procoagulant snake venom serine protease potentially having a dual, blood coagulation factor V and X-activating activity. Toxins 12(6), 358.

Lang Balija M., Leonardi, A., Brgles, M., Sviben, D., Kurtović, T., Halassy, B. and Križaj, I. (2020): Biological activities and proteomic profile of the venom of Vipera ursinii ssp., a very rare karst viper from Croatia. Toxins 12(3), 187.

Leonardi, A., Sajevic, T., Pungerčar, J. and Križaj, I. (2019): A comprehensive study of the proteome and transcriptome of the venom of the most venomous European viper: Discovery of a new subclass of ancestral snake venom metalloproteinase precursor-derived proteins. J. Proteome Res. 18, 2287–2309.

Šribar, J., Kovačič, L., Oberčkal, J., Ivanušec, A., Petan, T., Fox, J.W. and Križaj, I. (2019): The neurotoxic secreted phospholipase A2 from the Vipera a. ammodytes venom targets cytochrome c oxidase in neuronal mitochondria Sci. Rep. 9, 293.

Latinović, Z., Leonardi, A., Kovačič, L., Koh, C.Y., Šribar, J., Trampuš Bakija, A., Venkateswarlu D., Kini, R.M. and Križaj, I. (2018): The first intrinsic tenase complex inhibitor with serine protease structure offers a new perspective in anticoagulant therapy. Thromb. Haemost. 118(10), 1713–1728.

Latinović, Z., Leonardi, A, Šribar, J., Sajevic, T., Žužek, C.M., Frangež, R., Halassy, B., Trampuš-Bakija, A., Pungerčar, J. and Križaj, I. (2016): Venomics of Vipera berus berus; an explanation of differences in pathology elicited by Vipera ammodytes ammodytes envenomation: Therapeutic implications. J. Proteomics 146, 34–47.

Radovan Komel:

Kastelic, D., Soler, N., Komel, R. and Pompon, D. (2013): The Global Sequence Signature algorithm unveils a structural network surrounding heavy chain CDR3 Loop in Camelidae variable domains. Biochim. Biophys. Acta, Gen. Subj. 1830, 3373–3381.  [doi: 10.1016/j.bbagen.2013.02. 014]

Berne, S., Podobnik, B., Zupanec, N., Novak M., Kraševec, N., Turk, S., Korošec, B., Lah, L., Šuligoj, E., Stojan, J., Gobec, S. and Komel, R. (2012): Virtual screening yields inhibitors of novel antifungal drug target, benzoate 4-monooxygenase. J. Chem. Inf. Model. 52, 3053–3063. [doi: 10.1021/ci3004418]

Liović, M., Ožir, M., Bedina Zavec, A., Peternel, Š., Komel, R. and Zupančič, T. (2012): Inclusion bodies as potential vehicles for recombinant protein delivery into epithelial cells. Microb. Cell Factories 11, 67 [1–5].[doi: 10.1186/1475-2859-11-67]

Lah, L., Podobnik, B., Novak, M., Korošec, B., Berne, S., Vogelsang, M., Kraševec, N., Zupanec, N., Stojan, J., Bohlman, J. and Komel, R. (2011): The versatility of the fungal cytochrome P450 monooxygenase system is instrumental in xenobiotic detoxification. Mol. Microbiol. 85, 1374–1389.[doi: 10.1111/j.1365-2958.2011.07772.x]

Peternel, Š. and Komel, R. (2010): Isolation of biologically active nanomaterial (inclusion bodies) from bacterial cells. Microb. Cell Factories 9, 66 [1–16]. [doi: 10.1186/ 1475-2859-9-66]

Vogelsang, M., Comino, A., Zupanec, N., Hudler, P. and Komel, R. (2009): Assessing pathogenicity of MLH1 variants by co-expression of human MLH1 and PMS2 genes in yeast. BMC Cancer 9, 1–9. [doi: 10.1186/1471-2407-9-382]

Temeljni viri in literatura

WILLSON, K., WALKER, J. (Eds.), 2005. Principles and Techniques of Biochemistry and Molecular Biology; 6th Edition. Cambridge University Press, Cambridge (U.K.), 783 str., ISBN 0-521-82889-9.

S. B. Primrose and R. M. Twyman (2006): Principles of Gene Manipulation and Genomics; 7th Edition. Blackwell Publishing, Malden (U.S.A.), Oxford (U.K.), Carlton (Austr.), 390 str., ISBN: 1-4051-3544-1.

Zapiski predavanj, revijalni članki s področja, tekoča periodika, druga učna gradiva.