Preučevanje bioloških procesov na ravni genoma, transkriptoma in proteoma

Opis predmeta

Izziv današnjega raziskovalnega dela predstavlja povezovanje znanj in eksperimentalnih podatkov posameznih raziskovalnih področij (npr. genomika, transkriptomika, proteomika) in generacija vedno večjih setov podatkov. S tem individualnim raziskovalnim predmetom želimo podati študentu preko laboratorijskih primerov vpogled v konkretne raziskovalne primere in primere obdelav rezultatov s področij genomike, transkriptomike in proteomike:

1) Kvantificiranje DNA/RNA

Kvantificiranje DNA/RNA je obsežno področje, ki se široko uporablja v biotehnoloških raziskavah. Za določevanje tarčnega produkta se tako uporabljajo nekatere tradicionalne metode, kot npr. spektrofotometrija ali PicoGreen dsDNA kvantificiranje, ki niso vrstno specifične, medtem ko je zelo natančno določanje tarčnih genov / DNA / RNA omogočeno predvsem z metodami, ki temeljijo na tehnologiji verižne reakcije. Uporabljajo se v širokem obsegu za DNA kvantificiranje saj amplifikacija tarčne sekvence omogoča visoko občutljivost detekcije. Pri kvantitativnih PCR (QPCR) tehnikah je količina tarčnega gena povezana z intenziteto fluorescence reporterskih molekul. Signal fluorescence na osnovi katerega želimo izračunati začetno količino tarčnega gena lahko merimo na koncu reakcije (endpoint QPCR) ali pa med samim potekom reakcije (real-time QPCR). Novejša tehnologija imenovana digitalni PCR (dPCR) pa je verzija klasičnega PCR-ja, ki se lahko direktno uporablja za kvantificiranje in pomnoževanje nukleinskih kislin. Največja razlika med njima je v tem, da je pri dPCR vzorec razdeljen na veliko število manjših delov v katerih potekajo posamezne reakcije.

V sklopu tega predmeta se bodo študentje seznanili predvsem z uporabo in aplikacijami tehnologije PCR v realnem času, ki je zaenkrat najboj široko uporabna.

2) Obdelava genomskih in transkriptomskih NGS podatkov – uporabna bioinformatika

V zadnjih nekaj letih so postopki naslednjih generacij določevanja nukleotidnih zaporedij (NGS) povsem spremenili področje genomike in transkriptomike. V tem sklopu predmeta se bodo študenti seznanili z naslednjimi aktivnostmi:

a) Hiter vpogled s trenutnimi NGS tehnologijami, ki so aktualne

b) NCBI-jev arhiv »Sequence Read Archive«, čemu je namenjen, prenos surovih podatkov sekvenciranja različnih platform, seznanitev s formati teh podatkov, pretvorba podatkov s pomočjo programskega paketa »SRA Toolkit«

c) Analiza kvalitete NGS podatkov (QC analysis) in interpretacija analize

d) Čiščenje surovih NGS podatkov

e) Osnovni formati NGS podatkov, seznanitev z njimi, njihova obdelava (FASTQ, SAM, BAM, GFF, VCF, BED)

f) De-novo zlaganje in rekonstrukcija zaporedij na osnovi mapiranja

g) Vizualizacija NGS podatkov.

3) Preučevanje proteoma

Različni omski pristopi omogočajo preučevanje bioloških procesov na molekularni ravni. Med njimi ima proteomika pomembno prednost, kajti preučuje proteine, ki so nosilci funkcij vsake žive celice. Z uporabo različnih proteomskih orodij lahko pridobimo informacijo o izražanju proteinov, njihovih posttranslacijskih modifikacijah in proteinskih interakcijah.

Študenti se bodo v tem sklopu praktično seznanili z naslednjimi aktivnostmi:

– Priprava biološkega materiala – vzorčenje in priprava vzorca za proteomsko analizo

– Analiza proteoma z 2-D elektroforezo

– Obdelava 2-D slik gelov z računalniškim programom

– Vrednotenje rezultatov identifikacije proteinov, pridobljenih z masno spektroskopijo.

Predmet učimo na programih

Cilji in kompetence

Namen predmeta je:

1) predstaviti tehnike kvantificiranja DNA/RNA ter jih podpreti s konkretnimi laboratorijskimi poskusi in izračuni ter vrednotenji dobljenih rezultatov,

2) seznaniti študente z osnovnimi karakteristikami podatkov NGS, njihovimi oblikami, podatkovnimi bazami za shranjevanje, ter s potekom analize.

3) predstaviti analizo proteoma od priprave vzorca, separacije proteinov do vrednotenja proteomskih podatkov

Študenti bodo preko praktičnih primerov spoznali, kako razumeti biološke procese na ravni genoma, transkriptoma in proteoma in znali pravilno načrtovati eksperiment.

Metode poučevanja in učenja

Teoretične osnove
Praktično laboratorijsko delo oz. delo z računalnikom
Analiza rezultatov s pomočjo programske opreme in različnih računalniških aplikacij

Predvideni študijski rezultati

Znanje in razumevanje:

Pridobitev znanja s področja postavitve poskusa za PCR v realnem času
Razumevanje in poznavanje metod in tehnik za določanje količine tarčnega gena v vzorcu oz. izražanje posameznih tarč z metodo PCR v realnem času.
Analiza podatkov in vrednotenje rezultatov z različnimi metodološkimi pristopi.
Statistična analiza rezultatov in grafična predstavitev
Poznavanje osnov uporabne bioinformatike na primerih NGS podatkov
Poznavanje pomena proteomike za razumevanje bioloških procesov in sposobnost načrtovanja proteomskega eksperimenta od priprave biološkega materiala do analize proteoma z 2-D elektroforezo in obdelavo podatkov.

Temeljni viri in literatura

1) Real-time PCR handbook. 2012, Real-Time PCR 2nd Edition, Life Technologies Corporation (6 Chapters and 66 pages)

2) Bioinformatics for High Throughput Sequencing. Rodríguez-Ezpeleta, Naiara, Hackenberg, Michael, Aransay, Ana M. (Eds.) 2012, XI, 255p. 29 illus., 25 illus. in color.

3) Revialni in originalni znanstveni članki s področja/Review and original scientific articles from the field.